分光光度計(jì)在核酸的定量上也起著重要作用

　　分光光度計(jì)是指，使單色儀或特殊光源供給的特定波長(zhǎng)的單色光通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試樣和被分析試樣，比較兩者的光強(qiáng)度分析物質(zhì)成分的分光器。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器。

　　核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率比較高的功能?？梢詫?duì)可溶于緩沖液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈DNA和RNA進(jìn)行定量。核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)為260nm。由于每個(gè)核酸的分子結(jié)構(gòu)不同，因此其換算系數(shù)不同。要對(duì)不同類型的核酸進(jìn)行定量，需要預(yù)先選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算，得到了相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的步驟，輸入原液和稀釋液的體積，然后測(cè)試空白液和樣品液。但是，實(shí)驗(yàn)并不順利。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的機(jī)器，吸光值的漂移越大。

　　事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化。也就是說(shuō)，儀器有一定的精度和精度。另外，還需要考慮核酸本身的化學(xué)性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH、離子濃度等。測(cè)試時(shí)離子濃度過(guò)高時(shí)，讀取值有時(shí)會(huì)漂移，因此推薦使用像TE這樣pH值恒定、離子濃度低的緩沖液。

　　樣品的稀釋濃度也是不可忽視的因素：因?yàn)闃悠分胁豢杀苊獾卮嬖诩?xì)小的粒子，特別是核酸樣品。這些小粒子的存在會(huì)干擾測(cè)試效果。為了將粒子對(duì)檢查結(jié)果的影響控制在最小限度，核酸的吸光值優(yōu)選至少大于0.1A，吸光值優(yōu)選為0.1-1.5A。在這個(gè)范圍內(nèi)，粒子的干擾比較小，結(jié)果穩(wěn)定。因此，這意味著樣品的濃度不能過(guò)低或過(guò)高(超出光度計(jì)的測(cè)試范圍)。

　　最后是操作要素。如果混合不充分，吸光值太低，會(huì)出現(xiàn)負(fù)值?；旌弦褐胁荒艽嬖跉馀??？瞻滓褐袥](méi)有懸浮物。否則，讀數(shù)漂移會(huì)很劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品。不這樣做的話，濃度差異太大了；換算系數(shù)和樣品濃度單位的選擇一致；窗戶磨損的彩杯不能采用；樣品的體積必須達(dá)到彩杯所要求的最小體積等，有很多操作事項(xiàng)。

　　除了核酸濃度，分光光度計(jì)還同時(shí)給出了一些非常重要的比值，代表了樣品的純度。例如，A260/A280之比因?yàn)榈鞍椎奈辗鍨?80nm，所以用于評(píng)價(jià)樣品的純度。純樣本比大于1.8(DNA)或2.0)RNA)。比值小于1.8或2.0時(shí)，表示有蛋白質(zhì)或酚類的影響。A230表示樣品中存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物，比較純凈的核酸A260/A230之比大于2.0。檢測(cè)A320溶液的濁度和其他干擾因素。純樣品，A320一般為0。